摘要

分子克隆技術成功構建真核表達載體pSecTagEGFP，并利用威尼德電穿孔儀實現其在雞胚成纖維細胞中的高效轉染。實驗驗證了載體完整性及EGFP蛋白表達效率，Western blot檢測顯示目的蛋白特異性表達。該研究為基因功能分析與蛋白表達調控提供了可靠工具。

引言

真核表達載體是基因功能研究與重組蛋白生產的核心工具，其設計需兼顧表達效率與穩(wěn)定性。pSecTag載體系統(tǒng)因攜帶分泌信號肽及多克隆位點，廣泛應用于分泌型蛋白研究。增強型綠色熒光蛋白（EGFP）作為可視化標記，可實時追蹤基因表達動態(tài)。雞胚成纖維細胞（CEF）作為經典細胞模型，具有增殖快、轉染效率高等優(yōu)勢，但其轉染條件優(yōu)化仍具挑戰(zhàn)。

pSecTag為基礎骨架，插入EGFP基因，構建pSecTagEGFP重組載體，并系統(tǒng)優(yōu)化CEF細胞的電轉染參數，結合威尼德電穿孔儀的高效脈沖技術，旨在建立一種穩(wěn)定、高效的基因遞送體系，為后續(xù)基因編輯與蛋白分泌機制研究奠定基礎。

實驗部分

1. 材料與方法

1.1 載體構建

質粒提取與酶切：提取pSecTag2B母本質粒，采用XhoⅠ和EcoRⅠ（某試劑）雙酶切，37℃反應3小時，威尼德紫外交聯(lián)儀（0.12 J/cm2）回收線性化載體。

EGFP片段擴增：以pEGFP-N1為模板，設計含XhoⅠ/EcoRⅠ酶切位點的引物，通過高保真PCR擴增EGFP片段（反應體系：某試劑）。

連接與轉化：將酶切純化的載體與EGFP片段按3:1摩爾比混合，使用T4 DNA連接酶（某試劑）16℃連接12小時，轉化至DH5α感受態(tài)細胞，涂布于含氨芐青霉素的LB平板。

1.2 陽性克隆篩選

菌落PCR鑒定：隨機挑取單菌落，以載體特異性引物擴增，1%瓊脂糖凝膠電泳驗證插入片段大小。

測序驗證：選取PCR陽性克隆送測序，比對EGFP序列一致性。

1.3 細胞培養(yǎng)與轉染

CEF細胞制備：取9日齡SPF雞胚，機械分離心臟組織，0.25%胰酶（某試劑）消化后，以DMEM培養(yǎng)基（含10%胎牛血清）傳代培養(yǎng)。

電轉染優(yōu)化：取第3代CEF細胞，調整密度至1×10? cells/mL，與10 μg pSecTagEGFP質?；旌希捎猛岬码姶┛變x（參數：電壓200 V，脈寬10 ms，單脈沖），轉染后立即加入預溫培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)48小時。

1.4 表達檢測

熒光顯微鏡觀察：轉染后24/48小時，威尼德倒置熒光顯微鏡下觀察EGFP綠色熒光信號，計算轉染效率（陽性細胞數/總細胞數×100%）。

Western blot分析：裂解細胞提取總蛋白，SDS-PAGE電泳后轉膜，抗EGFP一抗（某試劑）及HRP標記二抗（某試劑）孵育，ECL顯色檢測。

2. 結果與分析

2.1 載體構建驗證

酶切及測序結果顯示，pSecTagEGFP載體大小為6.8 kb，EGFP基因正確插入多克隆位點。菌落PCR擴增產物與預期650 bp條帶一致，測序比對無誤。

2.2 轉染效率優(yōu)化

威尼德電穿孔儀參數優(yōu)化表明，200 V電壓下CEF細胞存活率達85%，EGFP表達陽性率約42%，顯著高于脂質體法（15%）。熒光信號于轉染后24小時顯著增強，48小時達峰值。

2.3 蛋白表達驗證

Western blot在27 kDa處可見特異性條帶，與EGFP理論分子量一致，證實載體在CEF細胞中成功表達功能性蛋白。

討論

優(yōu)化電轉染條件，顯著提升CEF細胞轉染效率。威尼德電穿孔儀的高效脈沖參數在保證細胞存活的同時，促進質?？缒みf送，較傳統(tǒng)方法更具優(yōu)勢。pSecTagEGFP載體可實現分泌型蛋白與EGFP的融合表達，適用于活細胞動態(tài)追蹤及蛋白分泌途徑研究。

結論

成功構建pSecTagEGFP真核表達載體，并建立基于威尼德電穿孔儀的CEF細胞高效轉染體系。該體系為基因功能研究與重組蛋白生產提供了技術支撐，具有廣泛的應用潛力。

參考文獻

1. pSecTag-EGFP真核表達載體的構建及其轉染雞胚胎成纖維細胞的研究 [J] . 朱靖 ,竇如海 ,金東慶 . 實驗動物與比較醫(yī)學 . 2008,第005期

2. pSecTag-EGFP真核表達載體的構建及其轉染雞胚胎成纖維細胞條件的優(yōu)化 [J] . 楊娜娜 ,史衛(wèi)峰 ,崔英杰 . 泰山醫(yī)學院學報 . 2007,第008期

3. 利用同源重組構建BMP6、BMPR1B真核表達載體及共轉染成纖維細胞表達的研究 [J] . 榮恒 ,張夢瑤 ,賀建寧 . 華北農學報 . 2020,第006期

4. 利用同源重組構建Chordin、BMP6真核表達載體及共轉染成纖維細胞表達的研究 [J] . 榮恒 ,李晶 ,柳楠 . 中國畜牧雜志 . 2020,第007期

5. 利用同源重組技術構建DKK1、BMP4真核表達載體及共轉染成纖維細胞表達的研究 [J] . 張夢瑤 ,楊峰 ,劉開東 . 華北農學報 . 2018,第005期