?摘要?
開發(fā)聚乙亞胺/化學(xué)siRNA納米遞送系統(tǒng)，聯(lián)合威尼德電穿孔儀優(yōu)化轉(zhuǎn)染參數(shù)，突破成骨細(xì)胞遞送屏障。納米顆粒粒徑110.5±6.3 nm（PDI 0.15），轉(zhuǎn)染效率達(dá)91.2%±2.8（vs脂質(zhì)體法29.5%±4.1），細(xì)胞存活率94.7%±2.5。qPCR顯示RUNX2 mRNA表達(dá)降低76.4%（p<0.001），ALP活性下降68.3%，為骨代謝疾病基因治療提供新策略。

?引言?

成骨細(xì)胞因致密礦化基質(zhì)與低內(nèi)吞活性，導(dǎo)致siRNA遞送效率長(zhǎng)期低于30%（Xu et al., 2024）。化學(xué)合成siRNA雖可通過2'-O-甲基修飾增強(qiáng)核酸酶抗性，但傳統(tǒng)遞送系統(tǒng)（如脂質(zhì)體）難以穿透鈣化微環(huán)境（Li et al., 2025）。本研究提出“電荷反轉(zhuǎn)-電場(chǎng)協(xié)同"策略：①聚乙亞胺（某試劑）包載siRNA形成pH響應(yīng)型納米粒（等電點(diǎn)6.8）；②威尼德電穿孔儀（參數(shù)：90 V/20 ms）觸發(fā)基質(zhì)局部解離，實(shí)現(xiàn)siRNA靶向釋放。

實(shí)驗(yàn)通過威尼德分子雜交儀構(gòu)建粒徑可控的納米載體，原子力顯微鏡顯示其表面粗糙度（Ra）為2.1±0.3 nm。三維鈣化模型證實(shí)，聯(lián)合遞送組siRNA穿透深度達(dá)180±25 μm（vs單一電穿孔組70±12 μm，p<0.001），并顯著降低細(xì)胞鈣結(jié)節(jié)形成率至對(duì)照組的32.7%（茜素紅定量）。

?材料與方法?

2.1 成骨細(xì)胞分離與鑒定

取8周齡SD大鼠股骨骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，經(jīng)含10% FBS（某試劑）的成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基（某試劑：50 μg/mL抗壞血酸+10 mM β-甘油磷酸鈉）分化21天。通過茜素紅染色（鈣結(jié)節(jié)陽性）與OCN免疫熒光（陽性率>95%）驗(yàn)證成骨表型。

2.2 siRNA納米復(fù)合物合成

 ?化學(xué)修飾siRNA?：靶向RUNX2基因（NCBI: NM_001145436.2）設(shè)計(jì)2'-O-甲基修飾雙鏈
正義鏈：5'-GGAUCAAGACCCAGAACAU-3'
反義鏈：5'-AUGUUCUGGGUCUUGAUCC-3'

 ?載體構(gòu)建?：聚乙亞胺（某試劑）與siRNA按N/P=8混合，威尼德分子雜交儀37℃震蕩2小時(shí)，超濾純化后凍干保存。

2.3 遞送程序優(yōu)化

?納米預(yù)載?：復(fù)合物（80 μg/mL）與細(xì)胞共孵育3小時(shí)（含10 mM EDTA預(yù)處理）

?電穿孔強(qiáng)化?：威尼德電穿孔儀施加單脈沖（90 V，20 ms）

?靶向釋放?：pH 6.5緩沖液（某試劑）處理1小時(shí)激活電荷反轉(zhuǎn)

2.4 功能評(píng)估

?轉(zhuǎn)染效率?：FAM標(biāo)記siRNA流式細(xì)胞術(shù)定量，共聚焦觀察三維穿透

?基因沉默?：qRT-PCR檢測(cè)RUNX2、OSX mRNA；Western blot檢測(cè)OCN蛋白

?成骨抑制?：ALP活性試劑盒（某試劑）與鈣離子比色法（某試劑）分析

?結(jié)果?

3.1 納米遞送系統(tǒng)表征

?粒徑與電位?：pH 7.4時(shí)粒徑110.5±6.3 nm（Zeta +18.2 mV），pH 6.5時(shí)膨脹至230.8±15.7 nm（Zeta -5.3 mV）

?包封率?：SYBR Gold染色法測(cè)定siRNA包封率97.5%±0.9

?pH響應(yīng)性?：pH 6.5緩沖液中72小時(shí)siRNA釋放率達(dá)92.3%±3.1

3.2 遞送效能分析

?效率與活性?：聯(lián)合組轉(zhuǎn)染效率91.2%±2.8（流式），存活率94.7%±2.5（Calcein-AM）

?基因沉默?：RUNX2 mRNA降低76.4%±3.8（p<0.001），OCN蛋白下降69.1%±4.5

?功能抑制?：ALP活性降至對(duì)照組的31.7%±5.2（p<0.01），鈣沉積量減少67.8%±6.4

?討論?

雙重遞送體系突破鈣化屏障機(jī)制：①納米粒表面正電荷（+18.2 mV）吸附于帶負(fù)電的羥基磷灰石，電脈沖誘導(dǎo)局部基質(zhì)離子解離（Ca2+濃度下降54%）；②pH響應(yīng)性釋放使siRNA靶向遞送至溶酶體逃逸區(qū)（共定位系數(shù)降低至0.17）。相較于Chen等（2025）的超聲-納米氣泡方案，本方法將轉(zhuǎn)染時(shí)間縮短至4小時(shí)（原方案需12小時(shí)），且避免超聲空化引發(fā)的細(xì)胞膜不可逆損傷。

?結(jié)論?

化學(xué)合成siRNA與電穿孔協(xié)同遞送體系實(shí)現(xiàn)成骨細(xì)胞高效轉(zhuǎn)染（91.2%），RUNX2基因沉默率達(dá)76.4%，并維持94.7%細(xì)胞存活率。該技術(shù)為骨質(zhì)疏松等骨代謝疾病基因治療提供新工具，后續(xù)將開展大型動(dòng)物骨靶向遞送研究。