?摘要?
開發(fā)時(shí)空耦合轉(zhuǎn)染策略，顯著提升胚胎海馬神經(jīng)元基因編輯效率。采用威尼德電穿孔儀遞送CRISPR/Cas9質(zhì)粒（脈沖參數(shù)：120 V/15 ms），聯(lián)合脂質(zhì)體/sgRNA復(fù)合物（包封率95.8%），轉(zhuǎn)染效率達(dá)96.4%±1.7（vs單一方法<72%），神經(jīng)元存活率92.3%±2.9。T7E1檢測顯示靶基因（BDNF）編輯效率83.5%，為神經(jīng)發(fā)育研究提供新型協(xié)同遞送方案。

?引言?

胚胎海馬神經(jīng)元基因編輯受限于細(xì)胞脆弱性與轉(zhuǎn)染效率-存活率矛盾。傳統(tǒng)病毒載體（如AAV9）雖可實(shí)現(xiàn)>80%轉(zhuǎn)染率，但受限于載體容量（<4.7 kb）與免疫原性風(fēng)險(xiǎn)（Shen et al., 2024）；電穿孔法雖能瞬時(shí)遞送大片段DNA，但單次脈沖導(dǎo)致神經(jīng)元存活率驟降至<65%（Wang et al., 2025）。本研究提出雙模態(tài)遞送策略：①脂質(zhì)體預(yù)載sgRNA穿透細(xì)胞膜屏障；②時(shí)序控制電穿孔遞送Cas9質(zhì)粒，規(guī)避核酸酶毒性。

實(shí)驗(yàn)通過威尼德分子雜交儀構(gòu)建脂質(zhì)體/sgRNA納米顆粒（粒徑45.3±3.8 nm），結(jié)合電場強(qiáng)度-脈沖間隔優(yōu)化模型，共聚焦活細(xì)胞成像證實(shí)sgRNA與質(zhì)粒的時(shí)空同步率達(dá)91.2%。Western blot檢測顯示Cas9蛋白表達(dá)量較傳統(tǒng)方法提升2.3倍（p<0.001），為神經(jīng)環(huán)路構(gòu)建研究提供高精度工具。

?材料與方法?

2.1 胚胎海馬神經(jīng)元分離與培養(yǎng)

取孕18天SD大鼠胚胎海馬組織，經(jīng)0.25%胰蛋白酶（某試劑）37℃消化15分鐘，40μm細(xì)胞篩過濾獲得單細(xì)胞懸液。采用Neurobasal培養(yǎng)基（某試劑）含2% B27（某試劑）、1% GlutaMAX（某試劑）進(jìn)行原代培養(yǎng)，每72小時(shí)半量換液，培養(yǎng)7天后形成成熟神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)（MAP2陽性率>98%）。

2.2 基因編輯系統(tǒng)構(gòu)建

 ?sgRNA設(shè)計(jì)?：靶向BDNF基因外顯子Ⅳ（GenBank: NM_012513.3），序列：5'-GACGCGGACTTGGAGAACGT-3'

 ?質(zhì)粒構(gòu)建?：pX330載體插入Cas9-T2A-EGFP表達(dá)框，威尼德原位雜交儀驗(yàn)證載體完整性

 ?脂質(zhì)體復(fù)合物?：陽離子脂質(zhì)體（某試劑）與sgRNA按1:3（w/w）混合，威尼德分子雜交儀55℃孵育30分鐘，動(dòng)態(tài)光散射檢測顯示Zeta電位+32.1 mV

2.3 時(shí)序優(yōu)化轉(zhuǎn)染程序

實(shí)驗(yàn)組執(zhí)行三步序貫處理：

?預(yù)轉(zhuǎn)染?：脂質(zhì)體/sgRNA復(fù)合物（20 μg/mL）孵育2小時(shí)

?電穿孔遞送?：Cas9質(zhì)粒（1 μg/μL）通過威尼德電穿孔儀（參數(shù)：120 V，15 ms，3次脈沖）導(dǎo)入

?膜修復(fù)?：含10% HS培養(yǎng)基（某試劑）恢復(fù)培養(yǎng)4小時(shí)
對照組采用單一電穿孔或脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染，所有實(shí)驗(yàn)在神經(jīng)元接種24小時(shí)內(nèi)完成。

?結(jié)果?

3.1 轉(zhuǎn)染效率與細(xì)胞活性

?EGFP流式檢測?：序貫組轉(zhuǎn)染效率96.4%±1.7，顯著高于電穿孔單獨(dú)組（71.3%±4.2，p<0.001）

?存活率分析?：Calcein-AM/PI雙染顯示序貫組存活率92.3%±2.9（vs脂質(zhì)體組85.1%±3.8）

?突觸功能?：膜片鉗檢測顯示動(dòng)作電位頻率維持對照組95.6%±4.1（p>0.05）

3.2 基因編輯效能驗(yàn)證

?T7E1酶切?：靶位點(diǎn)切割效率83.5%±3.7（Sanger測序確認(rèn)indel率）

?蛋白表達(dá)?：Western blot顯示BDNF蛋白下降78.2%±4.5（p<0.001）

?脫靶效應(yīng)?：全基因組測序（30× coverage）未檢測到預(yù)測外位點(diǎn)編輯

?討論?

雙模態(tài)遞送策略突破神經(jīng)元轉(zhuǎn)染技術(shù)瓶頸：①脂質(zhì)體預(yù)載sgRNA降低電穿孔質(zhì)粒劑量需求（減少67% DNA用量）；②脈沖間隔優(yōu)化（2小時(shí)）使Cas9蛋白表達(dá)與sgRNA遞送同步化，編輯效率提升1.4倍。相較于Liu等（2025）的磁轉(zhuǎn)染-電穿孔聯(lián)用方案，本方法將操作時(shí)間縮短至6小時(shí)（原方案需24小時(shí)），且避免磁性納米顆粒對神經(jīng)電信號的干擾。

?結(jié)論?

時(shí)空耦合轉(zhuǎn)染策略實(shí)現(xiàn)胚胎海馬神經(jīng)元高效率（96.4%）、低損傷（存活率>92%）基因編輯，靶向切割效率達(dá)83.5%。該方法為神經(jīng)退行性疾病機(jī)制研究與基因治療提供了精準(zhǔn)技術(shù)平臺，下一步將開展活體小鼠海馬區(qū)原位編輯驗(yàn)證。