摘要

本研究通過小細胞團和分散細胞混合物與兩種帶不同質(zhì)粒的農(nóng)桿菌共培養(yǎng)，成功將外源基因?qū)胴暩腆w胚，并通過DNA/DNA分子雜交鑒定確認基因整合與表達。構建了基于轉(zhuǎn)化體胚的人工種子，并初步探討了其萌發(fā)能力。本研究為柑桔類果樹外源基因轉(zhuǎn)移和遺傳改良提供了重要參考。

引言

特性與價值

貢柑（Citrus nobilis Lour. Gonggan）是我國的柑橘地方農(nóng)家優(yōu)良品種，具有果形靚麗、果色金黃、皮薄核少、肉脆化渣、高糖低酸等特點，被譽為“中華柑王"。其優(yōu)良的品質(zhì)和更好的口感使得貢柑在市場上受到廣泛歡迎，具有很高的經(jīng)濟價值。

構建遺傳轉(zhuǎn)化體系的意義

隨著基因工程技術的發(fā)展，通過外源基因?qū)敫牧甲魑锲贩N已成為現(xiàn)代育種的重要手段。構建貢柑的遺傳轉(zhuǎn)化體系，不僅可以提高貢柑的抗病蟲害能力、耐逆境能力等，還可以實現(xiàn)對其品質(zhì)性狀的定向改良，從而滿足市場對高品質(zhì)柑橘的需求。

材料與方法

實驗材料

1. 植物材料：選取健康、生長旺盛的貢柑植株，取其幼胚作為外植體。

2. 農(nóng)桿菌菌株：攜帶質(zhì)粒PGV3850:1103neo T-DNA（包含km抗性基因和Nos/Npt基因）和質(zhì)粒PGV517（包含Km抗性基因、NPTⅡ基因和毒蛋白基因）的農(nóng)桿菌。

3. 培養(yǎng)基：含有卡那霉素的選擇培養(yǎng)基，用于篩選抗性愈傷組織和幼胚。

實驗方法

1. 外植體準備：取貢柑幼胚，經(jīng)過消毒處理后，用小細胞團和分散細胞混合物作為外植體。

2. 共培養(yǎng)：將外植體與兩種帶不同質(zhì)粒的農(nóng)桿菌進行共培養(yǎng)，使外源基因?qū)胴暩碳毎?/p>

3. 選擇培養(yǎng)：在含有卡那霉素的選擇培養(yǎng)基上選擇出抗性愈傷組織和幼胚。

4. 基因整合與表達檢測：通過Nopalim和NPTⅡ酶性檢測、DNA/DNA分子雜交鑒定，確認外源基因是否整合到貢柑體胚的細胞基因組中并表達。

5. 人工種子制備：用3%海藻酸鈉包埋轉(zhuǎn)化體胚制備人工種子，并觀察其萌發(fā)情況。

實驗結果

抗性愈傷組織和幼胚的篩選

經(jīng)過選擇培養(yǎng)，成功從共培養(yǎng)的外植體中篩選出具有卡那霉素抗性的愈傷組織和幼胚。這些抗性組織在后續(xù)的培養(yǎng)中保持了良好的生長狀態(tài)。

基因整合與表達鑒定

通過Nopalim和NPTⅡ酶性檢測，發(fā)現(xiàn)部分抗性愈傷組織和幼胚具有NPTⅡ酶活性，表明NPTⅡ基因已成功導入并表達。進一步的DNA/DNA分子雜交鑒定結果顯示，Nos基因、NPTⅡ基因以及蘇云金桿菌的毒蛋白基因已整合到貢柑體胚的細胞基因組中。

人工種子制備與萌發(fā)

用3%海藻酸鈉包埋轉(zhuǎn)化體胚制備了人工種子。在適宜的萌發(fā)條件下，2粒轉(zhuǎn)基因人工種子成功萌發(fā)，表明所制備的人工種子具有萌發(fā)能力。

討論

外植體關鍵因素

外植體的選擇對于誘導體細胞胚的發(fā)生至關重要。在本研究中，選取了貢柑的幼胚作為外植體，這是因為幼胚具有較高的細胞全能性和胚性潛力，易于誘導形成體胚。此外，幼胚的發(fā)育程度對胚性愈傷組織的誘導也起決定性作用，因此在選擇外植體時需要嚴格控制其發(fā)育階段。

遺傳轉(zhuǎn)化策略

本研究采用了農(nóng)桿菌介導的遺傳轉(zhuǎn)化方法，成功將外源基因?qū)胴暩腆w胚。這種方法具有操作簡便、轉(zhuǎn)化效率高等優(yōu)點，是植物基因工程領域常用的轉(zhuǎn)化策略之一。在轉(zhuǎn)化過程中，質(zhì)粒的選擇和農(nóng)桿菌菌株的侵染能力是影響轉(zhuǎn)化效率的關鍵因素。本研究通過優(yōu)化共培養(yǎng)條件和篩選高侵染力的農(nóng)桿菌菌株，提高了外源基因的導入效率。

研究的創(chuàng)新與應用前景

1. 創(chuàng)新點：本研究在柑桔類果樹中實現(xiàn)了外源基因的轉(zhuǎn)移和表達，并成功構建了基于轉(zhuǎn)化體胚的人工種子。這一研究成果不僅豐富了柑桔類果樹的遺傳轉(zhuǎn)化體系，還為后續(xù)的品質(zhì)改良和抗病蟲害育種提供了重要參考。

2. 應用前景：通過外源基因的導入，可以實現(xiàn)對貢柑品質(zhì)性狀的定向改良，如提高糖度、降低酸度、增強抗病蟲害能力等。此外，人工種子的制備為貢柑的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)提供了新的途徑，有望降低生產(chǎn)成本、提高生產(chǎn)效率。

結論

本研究通過小細胞團和分散細胞混合物與兩種帶不同質(zhì)粒的農(nóng)桿菌共培養(yǎng)的方法，成功將外源基因?qū)胴暩腆w胚，并通過DNA/DNA分子雜交鑒定確認了基因的整合與表達。同時，構建了基于轉(zhuǎn)化體胚的人工種子，并初步探討了其萌發(fā)能力。這一研究成果為柑桔類果樹的外源基因轉(zhuǎn)移和遺傳改良提供了重要參考，具有廣闊的應用前景。