摘要：基因組原位雜交（Genomic in situ hybridization，GISH）作為一種強(qiáng)大的細(xì)胞遺傳學(xué)技術(shù)，在植物研究領(lǐng)域取得了諸多突破性進(jìn)展。本文全面綜述了 GISH 技術(shù)的近期革新要點(diǎn)，涵蓋探針標(biāo)記、雜交條件優(yōu)化以及信號檢測方法改良等層面。詳細(xì)闡述其在植物多倍體進(jìn)化分析、外源染色體鑒定、種子染色體行為研究中的具體應(yīng)用實(shí)例，結(jié)合創(chuàng)新性實(shí)驗(yàn)流程，展示如何精準(zhǔn)利用 GISH 技術(shù)剖析植物基因組結(jié)構(gòu)與功能，為植物遺傳育種、物種演化探究提供關(guān)鍵線索，助力植物學(xué)前沿研究攻克復(fù)雜的基因組學(xué)難題。
植物基因組復(fù)雜多樣，蘊(yùn)含豐富的遺傳信息，是植物適應(yīng)環(huán)境、進(jìn)化演變以及性狀表現(xiàn)的核心物質(zhì)基礎(chǔ)。解析植物基因組結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系，一直是植物學(xué)領(lǐng)域的重點(diǎn)研究方向。基因組原位雜交技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生，它猶如一把精細(xì)的分子手術(shù)刀，能夠直接在染色體水平上可視化特定 DNA 序列的分布與組織形式，為植物細(xì)胞遺傳學(xué)研究開辟了直觀、精準(zhǔn)的路徑。
早期 GISH 技術(shù)受限于探針標(biāo)記效率、雜交特異性不足以及信號分辨率低等問題，應(yīng)用范疇較為狹窄。但隨著分子生物學(xué)、生物化學(xué)及顯微鏡技術(shù)的迅猛發(fā)展，GISH 迎來革新浪潮，在植物多倍體物種形成機(jī)制闡釋、遠(yuǎn)緣種子育性剖析、野生種質(zhì)資源滲入追蹤等方面發(fā)揮不可替代的作用，逐漸成為植物科研工作者手中的得力工具。以下將深入探討 GISH 的技術(shù)新進(jìn)展及其在植物學(xué)界的多元應(yīng)用實(shí)例，穿插實(shí)驗(yàn)操作關(guān)鍵環(huán)節(jié)，以期為同行提供詳實(shí)技術(shù)參考與創(chuàng)新思路啟發(fā)。
傳統(tǒng)放射性探針標(biāo)記雖靈敏度高，但操作危險(xiǎn)、半衰期短，已逐漸被非放射性標(biāo)記取代。熒光素標(biāo)記成為主流趨勢，如 Cy3、Cy5 等熒光物質(zhì)，可通過缺口平移、PCR 擴(kuò)增等方式高效摻入探針 DNA 鏈。新型的 Click 化學(xué)標(biāo)記技術(shù)嶄露頭角，它基于生物正交化學(xué)反應(yīng)，能在溫和條件下將小分子熒光標(biāo)簽精準(zhǔn)連接到探針末端，顯著提升標(biāo)記特異性與穩(wěn)定性；實(shí)驗(yàn)操作時(shí)，先合成含炔基或疊氮基修飾的核苷酸前體，用于探針制備，后續(xù)與熒光偶聯(lián)試劑在細(xì)胞原位快速、定點(diǎn)反應(yīng)，生成高亮度熒光信號，降低背景干擾。
緩沖液配方改進(jìn)是關(guān)鍵一環(huán)。研發(fā)出的新型雜交緩沖液添加了去垢劑、 crowding 試劑（如葡聚糖硫酸酯），精準(zhǔn)調(diào)控溶液離子強(qiáng)度、pH 值，利于探針快速、均勻地?cái)U(kuò)散至染色體靶位點(diǎn)，增強(qiáng)雜交動力學(xué)效率；操作時(shí)需精準(zhǔn)稱量各成分，嚴(yán)格把控緩沖液配制流程，確保每次雜交條件一致性。溫度控制方面，引入智能溫控設(shè)備，實(shí)現(xiàn)變溫雜交程序，模擬生物體內(nèi) DNA 復(fù)性動態(tài)過程，初期高溫促使探針快速搜尋靶序列，隨后逐步降溫穩(wěn)定雜交雙鏈，提高雜交成功率與信號清晰度。
超高分辨率顯微鏡技術(shù)大放異彩，如結(jié)構(gòu)光照明顯微鏡（SIM）、受激輻射損耗顯微鏡（STED），突破傳統(tǒng)光學(xué)衍射極限，將 GISH 信號分辨率提升至納米級別，能精準(zhǔn)定位染色體細(xì)微結(jié)構(gòu)上的雜交位點(diǎn)；實(shí)驗(yàn)需配備專業(yè)顯微鏡成像系統(tǒng)，調(diào)整合適的激發(fā)光波長、曝光時(shí)間，捕捉微弱熒光信號。圖像分析軟件功能愈發(fā)強(qiáng)大，基于深度學(xué)習(xí)算法的軟件可自動識別、量化染色體及雜交信號，減少人工誤差，高效統(tǒng)計(jì)染色體數(shù)目、臂比及信號強(qiáng)度，為大規(guī)模樣本分析提供便利。
多倍體化是植物進(jìn)化的重要驅(qū)動力，GISH 助力解析其復(fù)雜歷程。以小麥屬為例，普通小麥（Triticum aestivum，六倍體）起源一直備受關(guān)注?？蒲袌F(tuán)隊(duì)提取野生二倍體祖先種（如節(jié)節(jié)麥、烏拉爾圖小麥）基因組 DNA 制備探針，與普通小麥中期染色體玻片雜交。實(shí)驗(yàn)流程涵蓋：精準(zhǔn)取材小麥幼嫩根尖，卡諾氏固定液處理后解離獲取高質(zhì)量染色體標(biāo)本；探針變性、雜交嚴(yán)格控溫，37℃孵育過夜；嚴(yán)謹(jǐn)洗脫未結(jié)合探針，熒光顯微鏡下觀測。結(jié)果清晰顯示不同基因組來源染色體片段在普通小麥核型中的分布，證實(shí)其多輪次雜交、染色體加倍進(jìn)化模式，明確祖先種基因組對小麥性狀塑造貢獻(xiàn)，為小麥遺傳改良、野生種質(zhì)挖掘指引方向。
在植物遠(yuǎn)緣雜交育種中，外源染色體導(dǎo)入是創(chuàng)制新材料的常用策略，GISH 可精準(zhǔn)鑒定其歸宿。在小黑麥（小麥與黑麥種子后代）培育里，用黑麥基因組總 DNA 標(biāo)記探針，與小黑麥染色體雜交。操作時(shí)優(yōu)化探針濃度，避免信號過強(qiáng)掩蓋小麥染色體信號；雜交后采用多輪分步洗脫，增強(qiáng)小麥 - 黑麥染色體區(qū)分度。圖像呈現(xiàn)鮮明雙色熒光，準(zhǔn)確標(biāo)定黑麥染色體片段大小、位置，判定其遺傳穩(wěn)定性，為篩選含目標(biāo)性狀且染色體穩(wěn)定的小黑麥株系提供關(guān)鍵依據(jù)，加速優(yōu)質(zhì)、抗逆小黑麥品種選育進(jìn)程。
植物種間、屬間種子常出現(xiàn)染色體聯(lián)會異常、分離紊亂，致育性降低。GISH 實(shí)時(shí)監(jiān)測種子減數(shù)分裂染色體動態(tài)。以煙草屬種間種子為例，取種子花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂前期 I 樣本制片，以雙親基因組 DNA 分別標(biāo)記不同熒光探針，雙色 GISH 同步觀察雙親染色體配對、交換情況。實(shí)驗(yàn)全程維持低溫、高濕環(huán)境，防止樣本干燥變形；巧妙調(diào)整熒光濾鏡組合，同步捕捉雙色信號。發(fā)現(xiàn)部分種子染色體存在同源區(qū)段錯(cuò)配、非同源聯(lián)會，直觀解釋種子不育分子機(jī)制，為后續(xù)染色體工程操作、育性恢復(fù)策略制定提供一手資料。
植物根尖是染色體觀察優(yōu)質(zhì)材料。上午 9 - 11 時(shí)取材，此時(shí)細(xì)胞分裂旺盛；根尖用清水洗凈后，迅速浸入預(yù)冷卡諾氏固定液（無水乙醇 : 冰醋酸 = 3 : 1），4℃固定 24 小時(shí)，充分固定細(xì)胞形態(tài)與染色體結(jié)構(gòu)。解離環(huán)節(jié)，用 1 mol/L 鹽酸 60℃水浴處理 8 - 12 分鐘，精準(zhǔn)把控時(shí)間，避免過度解離致染色體碎片化；解離后蒸餾水漂洗 3 - 5 次，移至載玻片，輕敲分散細(xì)胞，火焰干燥制片，確保染色體平整鋪展，利于后續(xù)雜交。
探針質(zhì)量決定雜交成敗。提取植物基因組 DNA 后，利用限制性內(nèi)切酶切割成長度適宜片段（0.5 - 2 kb），便于雜交穿透；標(biāo)記采用生物素、非放射性物質(zhì)時(shí)，嚴(yán)格遵循試劑盒流程操作，控制反應(yīng)體系各成分比例，如 dNTP 濃度、酶量，保證標(biāo)記效率。雜交體系構(gòu)建，每張玻片加 20 - 30 μL 雜交混合液（含探針、雜交緩沖液等），蓋上蓋玻片，周邊封蠟防蒸發(fā)；置于濕盒，37℃恒溫雜交 12 - 16 小時(shí)，期間維持盒內(nèi)濕度穩(wěn)定，保障雜交充分進(jìn)行。
雜交后洗脫嚴(yán)謹(jǐn)細(xì)致，依次用不同濃度、溫度 SSC 緩沖液漂洗，去除非特異性結(jié)合探針；檢測生物素標(biāo)記探針，用親和素 - 熒光素復(fù)合物孵育，標(biāo)記則用抗抗體 - 熒光素偶聯(lián)物，室溫避光反應(yīng) 1 - 2 小時(shí)，減少熒光淬滅。顯微鏡觀察熒光顯微鏡，暗視野下先用低倍鏡鎖定目標(biāo)染色體區(qū)域，再切換高倍鏡微調(diào)焦距、曝光時(shí)間；多色 GISH 實(shí)驗(yàn)依熒光素激發(fā)波長順序采集圖像，后期用專業(yè)圖像軟件疊加、處理，增強(qiáng)信號對比度、清晰度，如實(shí)還原染色體雜交圖景。
基因組原位雜交技術(shù)在植物領(lǐng)域潛能巨大，未來有望持續(xù)突破。在技術(shù)融合方向，與單細(xì)胞測序、三代測序技術(shù)聯(lián)動，整合染色體宏觀結(jié)構(gòu)與基因微觀序列信息，全方面解析植物基因組；開發(fā)原位雜交與基因編輯實(shí)時(shí)監(jiān)測體系，追蹤 CRISPR/Cas 系統(tǒng)在染色體靶位點(diǎn)編輯動態(tài)，優(yōu)化基因編輯流程。應(yīng)用拓展層面，聚焦瀕危植物，利用 GISH 揭示其更好基因組演化路徑，助力保育策略制定；深度參與全球氣候變化下植物適應(yīng)性研究，監(jiān)測關(guān)鍵基因、染色體片段變異，為作物抗逆育種輸送理論支撐，推動植物科學(xué)邁向分子精準(zhǔn)解析、種質(zhì)創(chuàng)新利用新紀(jì)元。
GISH 技術(shù)革新成果斐然，從探針設(shè)計(jì)到成像解讀全方面升級；在植物多倍體、雜交育種、染色體行為研究領(lǐng)域碩果累累，實(shí)驗(yàn)流程精細(xì)打磨。植物學(xué)界同仁借此可深挖植物基因組奧秘，攻克遺傳育種、物種保護(hù)難關(guān)，攜手在植物科學(xué)征程上揚(yáng)帆遠(yuǎn)航，解鎖更多未知遺傳密碼，培育綠色未來希望種苗。
